Preparación de Colorantes

 

Acetato mercúrico, líquido

Composición:

Acetato mercúrico--------------1g

Acido acético-----------------5 ml

Agua destilada------------1000 ml

 

Acetocarmín férrico

Carmín----------------------0.5 g

Acido acético (45%)------100 ml

Hervir hasta que tenga un color oscurecido.

Enfriar a temperatura ambiente.

Filtrar en papel de filtro Watman#1

Añadir gota a gto, hasta 1/2 de volumen de colorante, hierro clorhídrico 1M en ácido acético al 45% hasta que la solución se torne de un color azulado. Alternativamente, añadir gota a toga acetato férrico (saturado en ácido acético al 45 %) hasta el punto justo antes que se formen precipitados en la solución de carmín.

Añadir el resto del colorante.

Filtrar otra vez para eliminar los precipitados férricos inducidos.

 

Acido tánico

Composición:

Acido tánico----------------5 g

Agua destilada----hasta 100 ml

Añadir timol, fenol o azida (0.03% p/v) para inhibir la contaminación por microoganismos.

Filtrar antes de usar.

 

Azul II solución stock

Azul II-----------------------1g

Agua destilada-----------100 ml

 

Azul de anilina

Composición:

Esencia de clavo-------------100 ml

Alcohol etílico absoluto------100 ml

Azul de anilina (C.I. 42755)------1g

Preparar en frío

 

Azul de lactofenol

Composición:

Fenol-------------------------0,1 gr

Acido láctico------------------8 ml

Agua destilada---------------10 ml

Glicerina---------------------20 ml

Azul de anilina (C.I. 42755)--0.5 g

Se disuelve calentando ligeramente en fenol, el ácido láctico, el agua destilada y la glicerina; se deja enfriar y se añade el azul de anilina. Se deja reposar durante 24 horas. Se filtra y se guarda en botella de color topacio.

 

Azul de metileno

El azul de metileno se prepara en frío a distintas concentraciones dependiendo del uso que se quiera dar. Las dos más frecuentes son:

Composición: Existen diferentes formulaciones dependiendo del libro al que se consulte, las más usadas son las siguientes

1)Azul de metileno (C.I. 52015)--1 g

Agua destilada --------------1000 ml

 

2)Azul de metileno (C.I. 52015)--1 g

Boraz-----------------------------1g

Agua destilada ---------------100 ml

 

Azul de metileno-Alumbre

Composición:

Sulfato alumínico potásico-----10g

Agua destilada-------------100 ml

Azul de metileno (C.I. 52015)--1 g

Disolver primeramente en frío el alumbre potásico en agua destilada. Una vez disuelto el alumbre se añade el azul de metileno.

 

Azul de metileno-Azul B. Solución de tinción

Azul de Metileno-----------------0.130 g

Azul B---------------------------0.020 g

Glicerol----------------------------10 ml

Metanol-----------------------.----10 ml

Tampón fosfato (0.1 M, pH 6.9)---30 ml

Agua destilada---------------------50 ml

 

Azul de metileno de Loeffler

Composición:

Azul de metileno (C.I. 52015)-0.5 g

Solución al 1% de KOH-------1 ml

Alcohol 96º------------------30 ml

Agua destilada--------------100 ml

Disolver el Azul de Metileno en el agua calentada a 50ºC; posteriormente, añadir los otros ingredientes. Filtrar.

 

Azul de toluidina

Azul de toluidina------1 mg

Agua destilada----- 1000 ml

Utilizar tampón fosfato pH 5.5

 

Carmalum de Mayer

Sulfato de luminio amónico-----------0.5% (acuoso)

Acido carmínico---------------------0.5%

Disolver y filtrar (calentar si es necesario)

Acido salicílico----------------------0.1%

Es un buen colorante totalmente regresivo. Lavar bien en agua destilada o en solución de alumbre. El alumbre férrico debe ser sustituido por alumbre amónicopor encima.

 

Carmín acético

Composición:

Carmín (C.I. 75470)---------4-5 g

Acido acético---------------45 ml

Agua destilada--------------55 ml

Se disuelve el carmín en ácido acético al 45% y la disolución se calienta hasta ebullición durante una hora, teniendo la precaución de refrigerar continuamente los vapores para no variar la concentración; esto se consigue calentando la mezcla en un Erlenmeyer cerrado mediante un tapón de goma perforado a través del cual se pasa un serpentín de refrigeración.

 

Carmín-acético hidrato de cloral

Composición:

Carmín (C.I. 75470)----------2 g

Sulfato férrico---------------0.5 g

Acido acético glacial-------100 ml + 5 ml (para mordiente)

Hidrato de cloral-----------320 g (16 g/ 10 ml)

Agua destilada-------------100 ml + 5 ml (para mordiente)

Añadir los 100 ml de agua destilada a 100 ml de ácido acético glacial, a continuación añadirle el carmín y hervir suavemente durante 5 minutos en campana de gases. Por otra parte preparar el mordiente, sulfato férrico al 5%: disolver 0.5 g de sulfato férrico en 5 ml de agua destilada + 5 ml de ácido acético glacial. Una vez esté enfriado el colorante se le añade el mordiente y se deja enfriar. Finalmente se añade el hidrato de cloral y se guarda en la nevera.

 

Carmín alumbre

(Fórmula 2, Johansen)

Composición

Sulfato alumínico potásico-----4 g

Carmín (C.I. 75470)----------1 g

Agua destilada------------100 ml

Se disuelve en caliente el alumbre en agua, se añade el carmín y se mantiene en caliente sin llegar a ebullición durante una hora, pera lo cual es necesario colocar sobre el Elenmeyer un refrigerante, para evitar que se varíe la concentración. En cualquier caso se enrasa hasta el volumen primitivo con agua destilada.

 

Carmín alumbre de Grenacher

(Langeron, 1947; Martoja 1970, Gabe, 1968)

Composición:

Sulfato alumínico potásico-----4 g

Carmín (C.I. 75470)----------1 g

Agua destilada------------100 ml

Se disuelve en caliente el alumbre en agua, se añade el carmín y se mantiene en caliente sin llegar a ebullición durante una hora, pera lo cual es necesario colocar sobre el Elenmeyer un refrigerante, para evitar que se varíe la concentración. En cualquier caso se enrasa hasta el volumen primitivo con agua destilada.

 

Fabril

Composición:

Solución A

Azul de anilina--------------0.5 g

Lactofenol----------------100 ml

Solución B

Fucsina básica--------------0.5 g

Lactofenol----------------100 ml

Solución C

Yodo-----------------------0.3 g

Yoduro potásico------------0.6 g

Lactofenol----------------100 ml

Se mezclan 80 ml de la solución A, 20 ml de la solución B y 100 ml de la solución C. La conservación es indefinida.

 

Fluoroglucina

Composición:

Fluoroglucina-----------------8 g

Alcohol 96º---------------100 ml

 

Fucsina básica

Composición:

Diluir hasta conseguir una concentración 0.26% en agua

Diluir hasta conseguir una concentración 5.93% en alcohol

 

Para usarlo en tinción de tejidos encastrados en resinas epoxi:

Fucsina básica--------0.1g

EtOH, 50%---------10 ml

 

Fucsina básica de Ziehl

Composición:

Fucsina básica----------------1 g

Acido fénico------------------5 g

Alcohol etílico 96º----------10 ml

Mezclar en un mortero hasta conseguir un homogeneizado completo; una vez ligrado añdir lentamente:

Agua destilada--------------90 ml

Existen en el mercado formulaciones de Fucsina básica según Ziehl que evitan su preparación en el laboratorio.

 

Fucsina ácida

Composición:

Fucsina ácida-----------------1 g

EtOH 70%---------------100 ml

 

Gallocianina (solución stock)

Solución stock de Gallocianina

Solución de tinción de Gallocianina

Añadir el siguiente volumen de HCl a la solución stock de Gallocianina para preparar la solución de tinción.

Alumbre cobre*---------------0.5 g

Gallocianina------------------0.15 g

Agua destilada--------------100 ml

Hervir durante 5 minutos, enfirar y filtrar. Añadir más agua destilada para llegar a un volumen final de 100 ml. El pH debería ser 1.64. No almacenar durante más de 1 mes.

ml HCl 1.0 M
pH
ml NaOH 1 M
pH

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

0.83

0.90

0.92

0.94

1.02

1.10

1.14

1.18

1.29

1.44

1.64

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1.64

1.84

2.16

2.90

3.42

3.76

3.98

4.07

4.18

4.27

4.35

* Sulfato crómico potásico

 

Hemalun de Mayer

Composición:

Agua destilada----------------------1000 ml

Hematoxilina cristalizada (C.I. 75290)---1 g

Sulfato alumínico potásico--------------50 g

Iodato de sodio-----------------------0.2 g

Se disuelve el sulfato alumínico potásico (alumbre potásico) en 1 litro de agua destilada a temperatura ambiente; una vez disuelto, se le añade la hematoxilina y el iodato sódico. Este último se utiliza para la maduración rápida; pues es un oxidante que pasa la hematoxilina a hematina. Este colorante presenta un color violáceo intenso cuando está maduro.

Una variante de esta fórmula es el Hemalun ácido. Para obtenerlo se añade a la fórmula anterior:

Hidrato de cloral------------50 g

Acido cítrico-----------------1 g

El Hemalun ácido da una coloración nuclear más precisa y se conserva mucho mejor.

Formulación de Ruiz

Agua destilada (hirviendo)------------------------1000 ml

Sulfato alumínico potásico----------------------------20 g

Disolver

Añadir gota a gota Hematoxilina alcohólica al 10%---10 ml

Iodato sódico (NaIO3, 2% acuoso p/v)--------------10 ml

Enfriar y filtrar

Cuando aparece una espuma metálica, filtrar otra vez. Esta solución es mejor que se use en fresco pero puede ser almacenada durante unos meses.

 

Hematoxilina férrica de Heidenhain

Preparar los dos reactivos siguientes:

1.- Mordiente:

Sulfato amónico férrico-------3 g

Agua destilada------------100 ml

El sulfato amónico férrico presenta una coloración violeta claro; no confundir con el sulfato ferroso amónico o sal de Mohr, que presenta cristales verdes, ni tampoco utilizar los cristales alterados de sulfato alumínico férrico (cuando éste se ha alterado y presenta cristales amarillentos); seleccionar cuidadosamente los cristales y que presenten una coloración violeta pálido.

2.- Colorante:

Hematoxilina-----------------1 g

Alcohol de 90º-------------10 ml

Una vez disuelta la hematoxilina en el alcohol de 90º añadir agua destilada hasta completar 100 ml de colorante

 

Si se siguen las directrices de Ruiz:

Mordiente de alumbre férrico

Agua------------------500 ml

Acido acético glacial------5ml

Acido sulfúrico---------0.6 ml

Sulfato amónico férrico---15 g (Usar sólo cristales blancos, amarillos no)

o

Clorhídro férrico--------2-5%

La solución stock debe ser almacenada pero usar cualquier alícuota data como mordiente sólo una vez.

La tinción diferencial en clorhidro férrico al 1-3%.

 

Solución stock de Hematoxilina alcohólica

Hematoxilina en EtOH 100% (disolución al 10% p/v)

Disolver el colorante a 35ºC.

Oxidar teniendo la disolución durante 2 semanas abierta hasta que se haga un color rojo vino

Un método alternativo de oxidación es añadir "periodate" o algunod de los alumbres directamente a la soluciónd e hematoxilina.

 

Hematoxilina acuosa

Hematoxilina en agua destilada al 0.5% o diluir Hematoxilina alcohólica del 10% al 0.5 % en agua destilada.

Dejar reposar durante unos días antes de usarse.

 

Una formulación alternativa que debe ser usada inmediatamente es:

Hematoxilina alcohólica al 10%----5 ml

Metil celosolve-----------------100 ml

Agua destilada-------------------50 ml

Agua del grifo------------------- 50 ml

La solución debería ser un rojo vino oscuro, si no es así añadir un pellizco de bicarbonato sódico.

 

Hemisulfato de berberina

Diluir hasta conseguir una concentración 0.1% en agua.

 

Lugol

Composición:

Ioduro potásico------------1.5 g

Iodo-----------------------0.5 g

Agua destilada-------------25 ml

Los 0.5 g de Iodo se disuelven en unas gotas de alcohol; todo ello es llevado hasta 25 ml con agua destilada, a la que se le añade yoduro potásico hasta saturación. Este reactivo se hala comercializado en el mercado a concentraciones variables.

 

Naranja G

Composición:

Naranja G------------------2 g

Acido tánico----------------5 g

HCl (concentrado)----- 4 gotas

Agua destilada---- hasta 100 ml

Añadir timol, fenol o azida (0.03% p/v) para inhibir la contaminación por microorganismos. La azida puede ser usada en una concentración que oscile entre 0.03-0.1% p/v.

Filtrar antes de usar.

 

Naranja de Acridina

Naranja de acridina*---6.25 g

Agua destilada---------200 ml

NaOH (0.1 N)--------- 50 ml

*Esta es la cantidad que se cita en la bibliografía. Sin embargo, es indudablemente demasiado alta. El Naranja de Acridina debería estar en el rango de mm/ ml.

 

Orceína acética

Composición:

Orceína--------------------1-2 g

Acido acético--------------45 ml

Se disuelve la orceína en caliente a 60ºC en ácido acético, tomando las mismas precauciones que en el proceso de preparación del carmín, para evitar la evaporación del acético. Una vez enfriada la disolución, añadir

Agua destilada------------100 ml

 

Ruiz apuesta por una formulación diferente en concentración:

Orceína----------------------1-2 g

Acido acético (45%)-------100 ml

Disolver en ácido acético caliente.

Enfriar a temperatura ambiente

Filtrar en papel de filtro Whatman #1

 

Picrofucsina

Composición:

Solución A

Fucsina ácida---------------1.1 g

Agua destilada--------------10 ml

Solución B

Acido pícrico en solución acuosa saturada----100 ml

Tiene una duración de 8 a 10 meses

 

Rojo Burdeos

Diluir hasta conseguir una concentración 1% en agua.

 

Rojo de rutenio

Composición:

Agua destilada------------100 ml

Rojo de rutenio---------------1 g

Amoniaco-------------------1 ml

Esta solución, como se ha dicho anteriormente, hay que prepararla inmediatamente antes de su uso, dado que es inestable.

 

Safranina

Composición:

Alcohol etílico de 50º-----100 ml

Safranina (C.I. 50240)-------1 g

La preparación se realiza en frío.

En los manuales tando de histología animal como vegetal, figuran preparados con fórmulas distintas, tanto en las concentraciones de colorante como en la de disolvente (Martoja, 1970; Purvis-Collier-Walls 1966), Johansen 1968; Gabe, 1968; etc.). Nuestra experiencia es que, a concentraciones mayores de colorante, éste precipita fácilmente, siendo poco limpias las tinciones; y el exceso de colorant conlleva un exceso de coloración.

 

Sudán III

Composición:

Sudán III (C.I. 26100)-----2-3 g

Alcohol etílico------------100 ml

Se trata de una solución saturada de Sudán III en alcohol de 70º, ya que es insoluble en agua. La solución se prepara en caliente.

 

Tionina

Tionina--------------------0.5 g

Agua destilada-----------200 ml

NaOH (0.1 N)------------50 ml

EtOH 90%--------------250 ml

 

Tionina fenicada

Composición:

Tionina-----------------------1 g

Fenol----------------------2-5 g

Acido acético glacial-------20 ml

Agua destilada------------400 ml

 

Verde yodo

Composición:

Alcohol etílico 70º--------100 ml

Verde de yodo (C.I. 42556)-1 g

Prepararse en frío.

 

Verde luz

Se puede preparar tanto en disolución acuosa como alcohólica.

Composición:

Verde luz (C.I. 42095)-------1 g

Agua destilada------------100 ml

Sustituir el agua destilada por alcohol etílico de 96º para la solución alcohólica.

 

Verde de Metilo-Pironina Y

Verde de Metilo------------------------1 g

Tampón acetato (0.2 M, pH 4.8)----50 ml

Pyronina Y----------------------------0.1g

 

Purificación del Verde de Metilo

Agitar Verde de metilo en solución acuosa al 2% en un exceso de cloroformo o de alcohol amilo. El Violeta de Metilo con taminante se separará en la fracción de cloroformo después de unos días. La fase acuosa contendrá sólo Verde de Metilo puro.

 

Solución stock de Verde de Metilo-Pironia Y

Verde de metilo (purificado al 2% solución acusoa)---10 ml

Pironina Y (5% solución acuosa)--------------------17.5 ml

Agua destilada--------------------------------------250 ml

 

Solución de trabajo de Verde de Metilo- Pironina Y

Tampón acetato (0.2 M, pH 4.8)--------------------1 vol

Stock Verde de Metilo-Pironina Y------------------1 vol

Mezclar justo antes de usar y lamancenar como máximo una semana.

 

Verde rápido

Composición:-

Alcohol etílico absoluto-----50 ml

Esencia de clavo------------50 ml

Verde rápido (C.I. 42053)---1 g

 

Vesuvina o pardo Bismark

Vesubina (C.I. 21010)-------1 g

Fenol cristalizado-----------0.5 g

Agua destilada------------100 ml

Tras dejar reposar la disolución durante 1 hora se filtra.