Fijadores químicos

 

Acetato mercúrico.- Produce mejor fijación que el ácido acético.

 

Acido acético.- Conserva la cromatina. Retrae los tejidos. Es más un conservante que un fijador.

 

Acético-ósmico-dicromato

Se trata de un fijador básico que preserva principalmente mitocondrias, núcleo y algunas veces vacuolas. Enviado por Emmel y Cowdry, este fijador es excelente para mitocondrias. Debido a la presencia de ácido ósmico, la penetración en los tejidos es lenta y no extensiva; por eso se deben usar muestras pequeñas.

Dicromato potásico (2.5% acuoso)---8 ml

Acido ósmico (2% acuoso)-----------2ml

Acido acético glacial------------- una gota

Fijar muestras pequeñas durante 24-48 horas, lavar en agua, deshidratar e imbibir en parafina.

 

Acido acético.- Conserva la cromatina. retrae los tejidos. es más un conservante que un fijador.

 

Acido crómico.- Se utiliza en soluciones al 2%. Hay que tener precaución al usarlo, puesto que disuelve las láminas medias y las celulosas. Después de una fijación de 1-2 horas, se debe sacar la muestra del mismo y pasarla a un conservador. Es un buen fijador si se toman las precauciones debidas.

El ácido crómico como fijador es el más usado en investigación citológica. Es un oxidante fuerte y fijador coagulante y resulta en una fijación ácida mostrando buena preservación de los ácidos nucleicos y proteínas. Las sales de cromo se disocian en soluciones acuosas formando complejos Cr-O-Cr, que reaccionan tanto con lípidos como con proteínas. El cromo, en la forma de dicromato potásico, es uno de los pocos fijadores (los otros debidos al tetróxido de osmio y mercurio) que preserva lípidos.

El ácido crómico tiende a encoger los tejidos de manera que es usado más frecuentemente en combinación con ácido acético, que hincha los tejidos.

Formulación débil:

Acido crómico (10% acuoso)-----2,5 ml

Acido acético (10% acuoso)--------5 ml

Agua destilada-------------------92.5 ml

 

Formulación media:

Acido crómico (10% acuoso)-----7 ml

Acido acético (10% acuoso)-----10 ml

Agua destilada-------------------83 ml

 

Acroleína

La acroleína es un fijador que penetra rápidamente en los tejidos y es muy bueno para fijar tejidos delicados y preservar vacuolas y orgánulos subcelulares. Generalmente la acroleina se reserva para métodos preparatorios que utilizan como medio de imbibició plásticos, ya que las estructuras finas preservadas son retenidas pobremente por la parafina. La acroleína es inestable a la luz y a pH elevado, formando un disacril sólido.

La acroleína es un muy buen agente entrecruzador y puede reemplazar al glutaraldehido en la formulación de Karnovsky con paraformaldehido o puede ser utilizada sola. La acroleína también se ha mostrado que reacciona con ácidos grasos, por tanto estabilizando membranas. El papel de las microtécnicas clásicas de plantas de Feder y O'Brien describieron el uso de la fijación con acroleína e infiltración en glicol metacrilato.

Precaución: la acroleina es tóxica y un lacrimador extremadamente volátil. Tener cuidado cuando se maneje este fijador.

El procedimiento es el siguiente:

1.- Fijar los especímenes en acroleína al 10% (acuoso) en tampón fosfato, cacodilato, o en un tampón Good.

2.- Deshidratar químicamente por transferencia directamente a 2-metoxietanol (metil o etil celosolve) a una concentración 0.1 mM pH 6.8, 12-24 horas a 4ºC.

 

Carmín acético hidrato de cloral.- Se trata de un fijador y colorante al mismo tiempo para la tinción de protalos de helechos. La siguiente formulación está preparada para 200 ml de fijador.

1. Añadir 100 ml de agua destilada a 100 ml de ácido acético glacial.

2. Disolver en esta mezcla 2 g de carmín. Hervir suavemente durante 5 minutos en campana de gases.

3. Preparar el mordiente (sulfato férrico al 5%):por una parte añadir 0.5 g de sulfato férrico, por la otra 10 ml de la mezcla según la proporción: 0.5 ml de agua destilada + 5 ml de ácido acético glacial.

4. Dejar enfriar la mezcla de carmín.

5. Añadir el mordiente a la mezcla de carmín.

6. Filtrar el conjunto.

7. Añadir 320 g de hidrato de clorla (16 g /10 ml).

8. Guardar en nevera.

 

Etanol.- El único alcohol que se puede utilizar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el de 96º. Se debe usar junto con otros fijadores para potenciar la acción de los mismos, o como solución de otros fijadores, pero no solo, ya que tiene poco poder de penetración, es un mal fijador de núcleos y mediocre de citoplasmas, y retrae excesivamente los tejidos. Más que un verdero fijador, el etanol a baja concentración puede ser un buen conservador.

 

Fijador de Bouin

Acido acético glacial-----------------------------2.4 ml

Formaldehido, 37%-----------------------------11.9 ml

Acido pícrico solución, saturada------------ 35.7 ml

 

Fijador de Carnoy

El fijador de Carnoy es un fijador que contiene cloroformo. Penetra en tejidos extremadamente rápido y pude fijar piezas de tejido de pequeño tamaño en minutos en vez de las horas requeridas con otros fijadores. Los tejidos delicados pueden ser dañados cuando se transiferen de soluciones acuosas a este fijador, debido a la extrema hidrofobicidad del cloroformo y resultando en una deshidratación rápida de los tejidos. Reservar el fijador de Carnoy para muestras más fuertes. este fijador ha sido usado tradicionalmente para estructuras citológicas.

Etanol absoluto---------60 ml

Acido acético glacila----10 ml

Cloroformo-------------30 ml

Fija piezas de tejido de pequeño tamaño aproximadamente en 1 hora, lavar varias veces en alcohol absoluto, infiltrar e incrustar.

 

Fluido de Regaud

Se trata de un fijador básico utilizado con éxito en la fijación de mitocondrias de células de mamífero pero que puede ser útil para investigaciones en plantas.

Dicromato potásico (3% acuoso)----20 ml

Formalina (37%)----------------------5 ml

Fijar los tejidos durante 4 días cambiando el fijador diariamente. Entonces tratar con dicromato potásico al 3% durante otros 7 días, cambiando la disolución de dicromato también cada día. Lavar 2-3 veces en agua, deshidratar e infiltrar en parafina.

 

Etanol.- El único alcohol que se puede usar como fijador es el absoluto y con ciertas reservas el de 96. Se debe usar junto con otros fijadores para potenciar la acción de los mismos, o como solución de otros fijadores, pero no solo, ya que tiene poco poder de penetración, es un mal fijador de núcleos y mediocre de citoplasma, y retrae excesivamente los tejidos. más que un verdadero fijador, el etanol a baja concentración puede ser un buen conservador.

 

Etanol-Glicerina-Agua o Alcohol-Glicerina-Agua (G.A.W.)

Alcohol 96º-----1/3

Glicerina--------1/3

Agua destilada--1/3

Fijador lento y conservador perecedero, máximo dos años de permanencia en la solución. No endurece; para cortar por congelación debe lavarse la muestra en agua destilada un mínimo de cuatro horas.

Fijador de Chamberlain

Es un fijador de ácido crómico que ha mostrado ser útil para fijar tejidos delicados y para trabajo con embriones. La formulacion "débil" debe ser usada para meristemos de tallos y raíces, ovarios u óvulos aislados. La formulación "fuerte" ha sido utilizada con éxito para la preservación de musgos, algas, y hongos. Fija muestras de tejido muy pequeña en 24-48 horas, lavar con agua destilada y proceder a la realización de sercciones.

Formulación débil:

Acido crómico (10% acuoso)-----3 ml

Acido acético (10% acuoso)------7 ml

Agua destilada-------------------90 ml

 

Formulación fuerte:

Acido crómico (10% acuoso)----10 ml

Acido acético (10% acuoso)-----30 ml

Agua destilada-------------------60 ml

 

Fijador de Farmer

El fluido de Farmer es una solución fijadora anhidro que causa rápida deshidratación y fijación. como con el fijador de Carnoy, el rápido cambio de agua en el tejido puede causar graves alteraciones en los tejidos. Sin embargo estos dos fijadores son excelentes para investigación citológica.

Etanol 100%-----------75 ml

Acido acético glacial---25 ml

 

Fijadores Navashin

La combinación de sales de cromo, ácido acético y formalina se refiere generalmente a un "fluido Navashi" y se ubica mejor para la investigación citológica, pero estas soluciones son también exitosas como fijadores para propósitos generales de algunos tejidos. Los fijadores Navashin son mezclas de fijadores coagulantes (cromo) y no coagulantes (ácido acético y formalina), las proporciones relativas determinan el poder de fijación y el grado de daño de tejidos blandos. Los fijadores que contienten menores cantidades de cromo y ácido acético son adecuados para tejidos penetrables, delicados mientras que aquellos fijadores que contienen elevadas cantidades de cromo y ácido acético (y quizás otros solventes orgánicos) son más adecuados para la fijación de tejidos no penetrables o tejidos leñosos.

La mayoría de los fijadores Navashin se preparan como dos solucones stock: la solución "A" continene ácido acético y crómico y la solución "B" contiene la formalina. La combinación de diferentes cantidades de soluciones A más B da como resultado fijadores de diferente fuerza y dureza. Las soluciones stock deben ser hechas por adelantado y mantenidas a temperatura ambiente. Los fijadores tipo Navashi deberían ser preparados y usados inmediatamente, desde su mezcla, el ácido crómico se reducirá y disminuirá el potencial de fijación de la solución. Cuanto esto sucede la solución cambiará de color de naranga a verde o marrón. En este punto el fijador deja de ser útil y debería se desechado adecuadamente. No mantener tejidos en estos fijadores que contienen cromo.

Una formulación de Navashin, se refiere a los fijadores CRAF (ácido crómico, ácido acético, formalina y debe ser preparada en varias fuerzas. Esta clase de fijadores convienen para propósitos generales de fijación citológicas y morfológicas para muchos tipos diferentes debido a la variación en la fuerza de las diferentes formulaciones CRAF. Usa la formulación de menor número para tejidos delicados y el número mayor de formulación para tejidos más resistentes. La modificación de Belling del fluido Navashin se ha usado para cromosomas en célula madres del polen. Este es un fijador duro que preserva la cromatina, pero puede estar dañando a otros componentes celulares.

Formulación CRAF III

Solución A

Acido crómico (10% acuoso)----3 ml

Acido acético (10% acuoso)----20 ml

Solución B

Formalina----------------------10 ml

Agua destilada-----------------67 ml

 

Formulación CRAF IV

Solución A

Acido crómico (10% acuoso)----4 ml

Acido acético (10% acuoso)----30 ml

Solución B

Formalina----------------------10 ml

Agua destilada-----------------56 ml

 

Formulación CRAF V

Solución A

Acido crómico (10% acuoso)----5 ml

Acido acético (10% acuoso)----35 ml

Solución B

Formalina----------------------15 ml

Agua destilada-----------------45 ml

 

Fomulación Belling

Solución A

Acido crómico (10% acuoso)----6.7 ml

Acido acético (10% acuoso)------67 ml

Solución B

Formalina----------------------26.3 ml

Saponina (p/v)-------------------0.4ml

Estos fijadores que contienen cromo, en el procedimiento de fijación hay que mantener las muestras durante 12-48 horas a temperatura ambiente, lavar varias veces, deshidratar e imbibir en parafina siguiendo el procedimiento habitual. La adición de saponina en la formulación de Belling (0.3-0.5%), y/o 2% de maltosa o sorbitol puede facilitar la penetración de la mayoría de fijadores incluso en la fórmula original de Bellign.

Los tejidos hemos comentado que requieren lavados antes de un procesamiento posterior. El lavado puede hacer papilla los tejidos blandos, por tanto emplear tiempos de lavado corto. Utilizar redecillas de alambre, etc para coger muestras pequeñas en agua corriente. Conecta una mangera de goma al grifo y aplica el agua a baja presión. Lavar los tejidos durante 10 minutos.

Las fórmulas de Navashin deberían hacerse recientes antes de su uso. Después de 12-24 horas la solución se vuelve verdosa y no actúa mucho más como fijador pero continúa endureciendo tejidos.

 

Fijación fase partida

Un método de fijación diferente es la fijación en fase partida. En este método el fijador acuoso se mezcla con un disolvente orgánico, generalmente heptano, agitado, y usado inmediatamente. La solución forma un líquido en dos fases que penetra en estructuras hidrofóbicas o impermeables para permitir una fijación mucho más rápida del citoplasma. Mezcla 1:1 heptano:fijador acuoso, agitar vigorosamente, a continuación añadir los tejidos a la solución. La fijaca fijaión fase partida debe ser útil cuando los tejidos son impermeables a fijadores acuosos standar (por ejemplo hojas con cutícula fina, esporas y polen).

 

Fijador de Zirkle

Los tejidos fijados con fijadores básicos muestran preservación preferente de mitocondrias, núcleo, y (algunas veces) vacuolas, con el mantenimiento del citoplasma mayoritariamente disuelto. La cromatina y "spindles" son también disueltos. Se trata de un fijador bastante satisfactorio, dentro de los pocos que hay

Dicromato potásico------2.5 g

Dicromato amónico------2.5 g

Sulfato cúprico----------2.0 g

Agua destilanda-------400 ml

Fijar 24-48 horas, lavar con agua, deshidratar e imbibir en parafina.

Formaldehido.- El formol se utiliza en concentraciones del 10% comercial. es un fijador regular, práctico y fácil de manejar, tiene el inconveniente de polimerizar los fenoles libres, que son muy frecuentes en los vegetales y que una fijación prolongada los endurece excesivamente. No debe ser usado o se debe usar con ciertas precauciones en tejidos muy lignificados.

 

Formalina-calcio de Baker

Este es un fijador tradicional para estabilizar fosfolípidos y lípidos para investigación en microscopía de campo claro. Testar cada formulación I o II en tu tejido a experimentar. Fijar 6-24 horas a temperatura ambiente y lavar con agua destilada antes de un procesado posterior.

 

I

II

Formalina

10

10

Clorhidro de calcio (10% agua)

10

-

Acetato cálcico, monohidrato

-
2g

Agua destilada

80

90

 

Formol-Acético-Alcohol (F.A.A). Para preparar 100 ml.

Alcohol etílico de 50-70º-----90 ml.

Acido acético glacial-----------5 ml.

Formaldehido 40%------------5 ml.

Se trata de un buen fijador muy difundido entre los histólogos vegetales, que da bastante buen resultado para microscopía óptica. Buen fijador general para tallos, raíces y hojas. Sirve como conservador. Endurece.

Una fórmula alternativa propone mezclar a partes iguales en volumen, formaldehido al 4% en agua, alcohol de 70º y ácido acético glacial.

El ácido acético puede reaccionar con estructuras salinas (cristales de oxalato cálcico, y algunas otras) introduciendo variaciones en su forma y estructura que hay que tener en cuenta.

Conviene no tener las muestras demasiado tiempo (no sobrepasar las 48 horas), y pasarlas a alcohol de 70º, aunque es más correcto confeccionar los bloques cuanto antes y al macenarlos de esta forma por tiempo indefinido.

Una fórmula alternativa la obtenemos de Ruiz:

Alcohol etílico de 95%--------50 ml

Acido acético glacial------------5 ml

Formaldehido 37%------------10 ml

Agua destilada----------------35 ml

La concentración final es la misma, pero evita el paso de hacer la dilución previa del alcohol del 95%

 

Formaldehido-Alcohol. Para preparar 100 ml.

Alcohol etílico 96º-------------58 ml.

Agua destilada----------------38 ml.

Formaldehido 40%------------4 ml.

Fijador general y conservador para estudios anatómicos de material leñoso. Endurece.

 

Formaldehido-Alcohol-Propiónico (F.P.A.). Para preparar 100 ml.

Alcohol etílico de 50-70º-----90 ml.

Acido propiónico -------------5 ml.

Formaldehido 40%------------5 ml.

Mezcla recomendada para Briófitos y Pteridófitos. Produce endurecimiento de los tejidos.

Una fórmula alternativa la obtenemos de Ruiz:

Alcohol etílico de 95%--------50 ml

Acido propiónico---------------5 ml

Formaldehido 37%------------10 ml

Agua destilada----------------35 ml

La concentración final es la misma, pero evita el paso de hacer la dilución previa del alcohol del 95%

 

Glugaraldehido

El glutaraldehido es un excelente fijador para preservar estructuras delicadas de la célula cuando se usan resinas plásticas, pero también es un buen fijador estructural para la infiltración en parafina. Presenta dos grupos aldehido reactivos y por tante es un agente entrelazante muy fuerte. La tendencia a formar uniones cruzadas hace del glutaraldehido un fijador útil además para mantener la integridad estructural de los tejidos cuando se use un programa de fijación débil para inmunolocalización o para el tratamiento con proteasas para hibriación in situ. La penetración en tejidos es menor que la del formaldehido; por tanto hay que permitirle más tiempo ara la fijación. Si es posible, fijar los tejidos a temperaturas bajas (4ºC).

Algunas propiedades destacables del glutaraldehido pertenecientes al uso biológico:

- En solución el glutaraldehido no tiene carga y es capaz de atravesar membranas biológicas.

- Las propiedades de semipermeabiliad de las membranas celulares deben ser mantenidas después de la fijación con aldehído.

- La reacción entre el glutaraldehido y los compuestos biológicos (especialmente proteínas) crea una red de entrecurzamiento dentro del citoplasma. El entrecruzamiento es esencialmente irreversible.

- Bajo condiciones óptimas el entrecruzamiento ocurre en segundos o minutos. La el paso limitante es la tasa de difusión del glutaraldehido dentro del tejido.

- La reacción del glutaraldehido (y formaldehido) con proteínas producirá compuestos fluorescentes. La autoflurescencia resultante aparece como una emisión amarillo apagado que puden esconder algunas pruebas de fluorescencia.

- La reacción del glutaraldehido tiene poco efecto sobre la estructura terciara de proteínas, las cuales pueden dejar algunoas enzimas activas. Sin embargo, es la densa matriz de entrecruzamiento la que puede influenciar con reacciones de anticuerpos. Por tanto, evitar altas concentraciones de glutaraldehido cuando se preparen tejidos para la inmunolocalización.

El glutaraldehido tiene la mayor tendencia a polimerizar en solución, especialmente a pH superiores a 8. La polimerización reducirá la concentración efectiva de monómero e incrementa la concentración de la forma oligómera. Las formas poliméricas de fomaldehido y glutaraldehido poseen una capacidad similar de fijación pero penetran en los tejidos en una tasa mucho menor. La tasa de polimerización depende de la temperatura y del pH, con la menor tasa entre 1 y 4ºC, pH menor de 4.5. Comprobar la pureza de las soluciones usando un espectro de análisis UV. La solución de glutaraldehido muestra una gran absorbancia a l max de 235 nm cuando polimeriza o una menor absorbancia cuando no está polimerizado (0.78 para una solución al 1%). El fijador de glutaraldehido debería realizarse en fresco, mantener a 4ºC y usar dentro de un mes desde su preparación. El glutaraldehido concentrado comprado debería ser mantenido a 4ºC.

 

Karnosky (Glutaraldehido-paraformaldehido al 5%). Para preparar 100 ml.

Disolver 4 gr de paraformaldehido en 50 ml de agua, agitando y calentando a 60-70ºC. Se han de añadir 3-4 gotas de KOH 1N para aclarar la solución. Todo este proceso ha de realizarse utilizando un agitador magnético. Al llegar a los 70ºC se observará que la disolución, antes turbia, se torna rápidamente transparente. Se realizará el proceso en campana de extracción para no respirar lso vapores que resultan tóxicos.

Añadir 10 ml de glutaraldehido al 50%.

Verter a la solución, hasta alcanzar los 100 ml con tampón fosfato 0,1 M y pH 7.2

Concentraciones menores de esta mezcla dan lugar a resultados deficientes para la observación de cortes en microscopía electrónica de transmisión. Ello se debe a que el contenido hídrico de las vacuolas es alto y al penetrar el fijador, su concentración intracelular desciende considerablemente. De este modo estructuras que rápidamente degeneran, como las membranas, nose aprecian con nitidez, por una deficiente fijación.

El fijador se lleva al campo en nevera portátil para asegurarnos que no sobrepasen los 4ºC. El tiempo de fijación en esta mezcla nunca debe ser inferior a 12 horas para las muestras que nosotros manipulamos, aunque frecuentemente no se observa hundimiento de estas en el fijador hasta pasadas 20 horas. Podemos decir lo mismo que se indicaba para el fijador anterior en lo referente a la dificultad de penetración por la naturaleza de las flores y los pelos hidrófobos; es recomendable, sobre todo para las flores con un grado de madurez elevado fijar al vacío, esto supone una dificultad añadida al tener que mantener las muestras a baja temperatura en nevera; utilizamos para ello recipientes herméticos en los que se hace el vacío con una bomba de vacío manual y luego pasamos a la nevera.

Hay que lavar el fijador, como máximo, a las 24 horas, para evitar el excesivo endurecimiento. el lavado se lleva a cabo en tampón fosfato 1 molar a pH 7.2. Se pasan las muestras a un frasco con abunante tampón y se hacen 5 cambios de 1/2 hora cada uno. En el tampón y en nevera podemos mantener las muestras durante varios días sin que se aprecie ninguna alteración.

Ruiz, pone un procedimiento algo distinto al descrito anteriormente que añade algunos elemenos de control interesantes de mencionar.

1.- Para preparar 100 ml de fijador, disolver 2.5 g de PFA en 50 ml de agua destilada a 60-70ºC a un pH de 8 o mayor. Enfriar y ajustar entonces el pH con HCl hasta llegar aproximadamente a 7. Comprobar el pH con tiras reactivas, no usar un pH metro

2.- Añadir 0.5 ml de glutaraldehido al 50%.

3.- Diluir la solución hasta 100 ml con tampón fosfato 200 mM, 100 ml de tampón PIPE, o 100 mM de tampón cacodilato a pH 7.2.

4.- Fijar muestras pequeñas durante 2-6 horas a 4ºC. Tejidos mayores necesitarán una fijación más larga (overnight) y (probablemente) infiltración a vacío. Alternativamente usa de la técnica de microondas para muestras de tejidos.

5.- Lavar los tejidos con tres o más cambios de tampón, 10-30 minutos cada uno, y proceder con la deshidratación e imbibición.

 

Metanol-ácido acético (MAA)

Las anteras han sido fijadas con éxito para la investigación de cromosomas meióticos en estado paquiteno usando metanol-ácido acético. Quitar las anteras de los brotes florales seccionando en tampón citrato (citrato sódico 0.01 M, pH 4.6). Fijar las anteras en MAA reciente a -20ºC (3:1). Reemplazar el fijador dos veces a intervalos de 5 minutos y después mntener las anteras en el fijador a -20ºC durante 2-24 horas. Lavar en tampón o agua destilada antes de su observación. El metanol-ácido acético preserva la estructura de los cromosomas pero normalmente disuelve el citoplasma.

 

Mezcla Cromo-Acética. Para preparar 100 ml.

a) Débil:

Anhidrido crómico, solución acuosa al 10%-----------2,5 ml.

Acido acético al 10%-----------------------------------5 ml.

Agua destilada---------------------------------------72,5 ml.

Fijador para Algas filamentosas, Hongos y Briofitos.

 

b) Media:

Anhidrido crómico, solución acuosa al 10%-------------7 ml.

Acido acético al 10%----------------------------------10 ml.

Agua destilada-----------------------------------------83 ml.

Se recomienda añadir 0,5% de saponina para aumentar el poder de penetración del fijador. Tras fijar el material duratne 24 horas, debe lavarse abundantemente en agua corriente y pasar a un conservador. es un buen fijador para ápices.

 

Mezcla Cromo-Acético-Formaldehido (C.R.A.F.)

Solución a)

Acido crómico-------------------------------------------1gr.

Acido acético glacial------------------------------------7 ml.

Agua destilada-----------------------------------------92 ml.

 

Solución b)

Formaldehido 40%-----------------------------------30 ml.

Agua destilada ---------------------------------------70 ml.

Ambas soluciones se deben mezclar en partes iguales, inmediatamente antes de su uso y tras una fijación de 12-24 horas, el material debe ser lavado en alcohol de 70º.

 

Paraformaldehido

El paraformaldehido (PFA, polioximetileno) es la forma polimerizada del formaldehido. El PFA es estable cuando se mantiene a 4ºC-temperatura ambiente pero liberará cantidades crecientes de gas formaldehido cuando se disuelvan en agua o tampón. Por esta razón el paraformaldehido es la forma preferida del fijador cuando hacemos experimentos críticos. Si estamos usando formaldehido o PFA, el agente fijador es el monómero de formaldehido (o una mezcla del monómero y polímeros de pequeño peso molecular). El PFA debería ser usado cuando la calidad del fijador sea crítica y la concentración exácta de formaldehido deba ser controlada. Para la fijación histológica general cosecharemos resultados satisfactorios. Disolver paraformaldehido en polvo en agua a 60ºC y añadiremos KOH para llevar el pH sobre 8. Cuando esté disuelto, añadiremos un volumen de dos veces la cantidad de paraformaldehido pero de tampón (0.2 M PO4, 0.2 PIPES, etc.) y pH 7.2).

El formaldehido solo, o una m ezcla que contenga formaldehido y glutaraldehido, es ubeno para la inmunolocalización o hibriación in situ. Provee al tejido de una gran estabiliad sin formar una matriz de entrecruzamientos caracterizada por una mayor concentración de glutaraldehido. Los tejidos fijadoes en esta mezcla son penetrables por anticuerpos y pruebas de ácidos nucleicos con un tratamiento mínimo de proteasas.

 

Solución de Allen

Este fijador citológico es un reemplazo de la solución de Bouin. Tener en cuenta que esta solución contiene ácido pícrico y puede formar precipitados insolubles que pueden interferir con la tinción, por eso asegurarse de lavar los tejidos concienciudamente después de la fijación. Como con otros fijadores que contienen cromo, mezclar justo antes de su uso. Fijar overnight hasta 24 horas, lavar en etanol de 70º hasta que el ácido pícrico amarillo se elimine, y continuar con el procesado.

Agua----------------------75 ml

Formalina (37-40%)-------15 ml

Acido acético glacial-------10 ml

Acido pícrico------------------1g

Urea---------------------------1g

Acido crómico (opcional)------1g

 

Solución de Bouin

La solución fuerte de Bouin se ha utilizado con éxito para preservar imágenes de la telofase en ápices de raíz y sacos embrionarios. La solución débil se usó para preservar fosfolípidos para la subsiguiente identificación usándo Naranga G y Azul de anilina. Fijar durante 12-24 h, lavar en etanol de 20% para eliminar resíduos de ácido pícrico (Ten cuidado cuando manejes ácido pícrico puro porque puede volverse explosivo si deshidrata más de la cuenta), entonces proceder con la deshidratación en imbibición. Los resíduos de ácido pícrico pueden interferir con la tinción de tejidos, por eso asegurarse de lavar concienzudamente los tejidos antes de continuar con el proceso. Los tejidos pueden ser lavados usando un sistema de un tubo de goma conectado al grifo y haciendo circular el agua que da con las muestras que están introducidad en una rejilla metálica.

Bouning fuerte

Bounign débil

Formalina---------------15 ml

Acido pícrico (1.3%)----75ml

Acido acético glacial-----5 ml

Formalina------------10 ml

Acido pícrico (5%)---50 ml

Acido acético glacial---5 ml

Agua destilada--------35 ml

 

Solución de Flemming

La solución de Flemming es un buen fijador citológico que contiene el cromo como agente coagulante y el fijador aditivo tetróxido de osmio. La fijación con tetróxido de osmio se retringe a las paredes celulares exteriores debito a su baja tasa de penetración en tejidos, mientras que el ácido acético entra concienzudamente en los tejidos. Por tanto, este es el mejor uso de la solución de Flemming sobre muestras de tejido de tamaño pequeño.

La solución "fuerte" fue uno de los fijadores más tenidos en cuenta en estos días. La solución más débil está reservada generalmente para tejidos delicados. Prueba para determinar qué fórmula (o modificación) es la mejor para tu material particular.

Prepara el fijador en dos soluciones stock: la solución A contendrá los ácidos crómicos y acético y la B contendrá sólo ácido ósmico (tetróxido de osmio). Añade la solución de osmio sólo antes de su uso. Fija piezas de tamaño muy pequeño durante 24-48 horas, lavar concienzudamente, y preparar para seccionar como es habitual. Los tejidos fijados con osmio necesitan ser blanqueados con lejía antes de su tición.

Precaución: el ácido ósmico es un compuesto volátil extremadamente tóxico. Puede fijar córneas y otros tejidos a través de una fijación con vapores. Emplear preacuciones especiales y usar siempre en campana extractora de gases.

 

Débil

Fuerte

Acido crómico (1%)

Acido acético (1%)

Acido acético glacial

Agua destilada

25

10

-

55

75

-

5

-

Acido ósmico (2% acuoso)

10

20

 

Teróxido de osmio

Aunque no es un fijador común para microscopía de campo claro, el tetróxido de osmio tiene un entrecruzamiento extermadamente útil, fijador aditivo para estabilizar lípidos y por tanto la estructura de membranas. Uno de sus ventajas es la posibilidad de entrecruzar carbonos insaturados que se encuentran en la bicapa lipídica de membranas y posiblemente con grupos aromáticos del triptófano y la histidina. Ambas proteínas y lípidos deben ser entrecruzados por reacción química con tetróxido de osmio. Este compuesto casi no muestra reactividad con los ácidos nucleicos o carbohidratos, aunque hay autores que sugieren que la exposición al ácido débil podría mostrar ácidos nucleicos (y proteínas) susceptibles a la reacción del tetróxido de osmio.

El tetróxido de osmio vuelve los tejidos negros y para ser útiles a la microscopía de campo claro los tejidos deberían ser blanqueados. Por esta razón y debido a su toxicidad, el tetróxido de osmio no está recomendado para propósitos generales de microscopía de campo claro. Tratar las secciones 5 minutos a temperatura ambiente con ácido periódico o "Oxone" al 1% (acuoso, peso/volumen) para convertir el tetróxido de osmio en un dióxido de osmio menos tóxico.