Inclusión en resina

En el mercado existen muchas resinas pero, para incluir tejidos vegetales, no todas dan buenos resultados; nosostros, despueés de probar varias, hemos constatado que la más adecuada para nuestros intereses es la LR White de la casa London Resin Company. También resulta bastante buena la resina Spurr, pero su elevada viscosidad la hace poco adecuada para volúmenes grades.

La LR White, con la que vamos a trabajar es una resina muy fluida que penetra muy bien, es miscible con el etanol y no totalmente hidrófoba. Pero lo que la hace idónea es la gran facilidad con que penetran los colorantes una vez polimerizada.

Si tomamos las indicaciones de Ruiz.

Las resinas London, LR Gold (LRG) y LR White (LRW), y la resina acrílica Unicryl, pueden ser útiles para experimentos relacionados con la inmunolocalización. Estas resinas son mezclas hidrofílicas y son compatibles con los tejidos deshidratados con EtOH a menos del 100% (debes comenzar la infiltración a sólo el 70%, pero esto no está recomendado debido a que se puede producir retracciones severas). Para la inmunolocalización, los tejidos deben ser fijados a 4ºC en formaldehido libre de metanol al 3-4% osmicado. La polimerización se ve inhibida por la acetona, por tanto evitar este disolvente así como el 2,2-dimetoxipropano (el cual puede contener acetona residual) para la deshidratación.

* Debería usarse LR White si se desee realizar encastrado a temperatura ambienteo termal. LR White es probablemente más útil para investigaciones histológicas debido a las mayores temperaturas con las que se le relaciona.

* La LR Gold (LRG) se recomienda para infiltración a bajas temperaturas (4ºC hasta 25ºC) y el encastrado, tejidos no fijados o fijados ligeramente con aldehidos. Los pequeños especímenes ( 3 mm3 ) deberían ser procesados en viales bien tapados a temperaturas bajo cero usando infiltración con fluidos previamente enfriados. Añadir polivinilpirrolidona 40 (PVP40) para proteger los tejidos contra el daño osmótico. Disolver PVP en metanol o EtOH. Usar LRG para investigaciones histológicas y de localización (inmunolocalización e hibridación in situ).

* Unicril es una resina que infiltra y polimeriza a bajas temperaturas que es un reemplazo para el medio de encastración en microscopía electrónica Lowacryl KM4. Se ha informado que se corta por fractura, mejor que por cortes, el cual puede exponer más antígeno a la superficie. Unicryl es hidrofílica y puede ser teñido por un gran número de colorantes acuosos.

Usar el siguiente procedimiento para infiltrar tejidos, empezando con EtOH 100%. La temperatura de infiltración debe ser de -25ºC hasta temperatura ambiente (-20ºC es la más común para inmunolocalización). Las muestras deben mantenerse en resina no polimerizada a 4ºC durante varias semanas.

Iniciadores

* Para polimerización de LRG y Unicryl usar radiación UV, los iniciadores son éter de metil benzooina al 0.5% (p/v) o benzil al 0.1% (p/v). Para muestras duras tales como semillas, esporas, polen o madera, añadir entre 0.05-0.1% de bencil.

* LRW polimerzia a 60-50ºC durante 12-20 horas sin la adición de acelerante, o a temperatura ambiente usando peróxido de benzoil (0.5% p/v) o "Acelerador para LR White".

* Unicryl polimerizará a temperatura ambiente con un 1.3% de peróxido de benzoil.

Infiltración

Paso
Solución
Tiempo
1
EtOH 100%
1 h
2
60% del monómero + 40% de EtOH 100%
1 h
3
70% del monómero + 30% de EtOH 100%
1 h
4
Monómero al 100 %
1 h
5
Monómero al 100% + acelerador (opcional para LRW)
1 h
6
Monómero al 100% + acelerador (opcional para LRW)
Overnight
7
Monómero al 100% + acelerador (opcional para LRW)
20-25 h

Encastración

Tanto el LR Gold como el Unicryl deben ser polimerizados con irradiación UV a bajas temperaturas (4ºC hasta 25 ºC). La mezcla de monómeros más el catalizador (éter de metil benzoina, 0.5% o benzil, 0.1%, p/v) se vierte en un molde ajustado, y se pone el especimen. Los moldes de encastrado pueden ser Eppendorfs o moldes especiales apra JB-4. Eliminar el oxígeno durante la polimerización con luz UV cubriendo la muestra con Parafilm o usando un método alternativo. Situar la muestra bajo la luz UV y polimerizar ininterrumpidamente overnight a 4ºC. Las burbujas en el bloque de metacrilato pueden ser eliminadas si la fuente de luz UV se pone bajo los moldes causando que la polimerización se realice desde la parte inferior hacia la parte superior.

LR Gold y Unicryl pueden ser también poimerizadas a -25ºC en un criostato. Para ello poner las muestras el monómero y el acelerador dentro de la cámara e irradiar a través a través de la tapa de cristal con un iluminador UV de onda larga portátil overnight durante 4 días. Continuar el proceso de resina a 4ºC durante 7 días más.

Polimerizar la LR White overnight usando peróxido de benzoil al 0.5% (p/v) o a 60-65ºC durante 12-20 horas sin la adición del acelerador. Verter dentro de un molde adecuado, e introducir el especimen. Los moldes de encastrado pueden ser Eppendorf o moldes JB-4 o algún otro molde de plástico. Incubar la LR White acelerada en hielo debido a que tiene una reacción exotérmica que puede dañar los tejidos.

 

Procedimiento de microondas para resinas LR

Puedes usar también la polimerización con microondas. Los monómeros LR más el acelerado peróxido de benzoil pueden ser polimerizados en un horno microondas. Infiltrar los tejidos según el procedimiento habitual e incluir peróxido de benzoil al 0.1% en el paso final de infiltración. Poner el molde de la muestra en un baño de María y microondas 5-7 minutos (en posición bajo o al 20%). Limitar la temperatura a 65ºC para evitar que suceda un daño en el tejido. Poner el comprobador de temperatura a prueba en el baño de María y no en el plástico.

La opción que ofrecen los apuntes originales de la asignatura se describen a continuación.

Tras la deshidratación en la serie de alcoholes y cuando la muestra está en alcohol absoluto, se agrega la resina en proporción 2:1 (dos partes de alcohol y una de resina), se mantiene la mezcla 12 horas y se añade la resina hasta completar la proporción 2:2, otras doce horas. Tras ellos se añade más resina hasta conseguir la proporción 1:2 y se deja el frasco destapado a temperatura ambiente toda una noche para que se evapore el alcohol. Al día siguiente se pasa la muestra a un frasco de resina pura y se deja 24 horas en nevera para asegurarnos una completa y total penetración, tras ello los colocamos en los moldes correspondientes, orientamos las muestras y los pasamos a la estufa a 60ºC para que polimerice la resina. La duración del proceso de polimerización es de 24 a 48 horas. Es muy importante que los moldes estén tapados, ya que el contacto de la resina con el oxígeno impide una correcta polimerización. Desaconsejamos utilizar moldes desilicona que, aunque son muy cómodos para la orientación de las muestras, no pueden cerrarse herméticamente. Nosotros hemos utilizado cápsulas BEEM de 3 y 6 mm de diámetro y cápsulas de gelatina. De forma esquemática se puede representar en el siguiente resumen

1.- Alcohol etílico 96º---------------------------------------------------1/2 hora

2.- Alcohol etílico 96º---------------------------------------------------1/2 hora

3.- Alcohol etílico absoluto----------------------------------------------1/2 hora

4.- Alcohol etílico absoluto----------------------------------------------1/2 hora

5.- Alcohol etílico absoluto----------------------------------------------1/2 hora

6.- Retirar el Alcohol etílico absoluto

7.- Añadir Alcohol etílico absoluto y resina hasta la proporción 2:1 -------12 horas

8.- Añadir resina hasta la proporción 2:2 ---------------------------------12 horas

9.- Pasar la muestra a otro frasco con resina pura (en nevera)-------------24 horas

10.- Orientación de la muestra, tapar el molde y polimerizar a 60ºC---24/48 horas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Alternativamente, y dependiendo del tipo de muestra se pueden variar los tiempos de infiltración en la resina reduciendo los tiempos de espera a 1 hora.

El proceso descrito puede hacerse al vacío, lo que permite, sobre todo en las muestras de tamaño grande, una infiltración más rápida y completa.

Si la resina está en buen estado y el proceso se ha hecho de forma correcta, el aspecto del bloque debe ser transparente y no presentar ninguna tonalidad.

Los bloques se etiquetan y se guardan en un frasco de vidrio cerrado.

 

Orientación de muestras en el monómero plástico

Es difícil de mantener en el lado correcto durante el lento proceso de polimerización; por ello se presenta un método alternativo

1. Polimerizar una fina capa de plástico en la base del molde. Este se realiza con más facilidad usando plásticos polimerizados con luz UV.

2. Poner la muestra horizontalmente en la parte superior de la base plástica y cubrir con más monómero plástico.

3. Completar el proceso de polimerización, encastrando la muestra en el centro del bloque de plástico.

4. Para realizar cortes, rotar 90º y orientar el bloque de manera que la costura entre las capas plásticas toque el margen de la cuchilla antes que la muestra de tejido. Esto disminuye la probabilidad que se separen las dos capas cuando realices cortes transversales.