Montaje de cubreobjetos

El cubreobjetos es casi lo que más se necesita en una muestra para microscopio para proteger la delicada sección y suministrar un camino óptico claro. Elegir un tamaño que solo cubra la sección. Los tamaños estándar son 22x22 mm, 20x30 mm, 20x40 mm, etc. Los cubreobjetos vienen en una serie de grosores designados como los siguientes:

Designación
Grosor
#1
0.13-0.17 mm
#1
0.16-0.19 mm
#2
0.17-0.25 mm

La mayoría de los objetivos de los microscopios están corregidos ópticamente para el cubreobjetos para un grosor único- generalmente 0.17 mm o #1- de modo que hay que asegurarse esto. El grosor del cubreobjetos están estampados sobre los objetivos bien como "17" o "0.17". Cuando se hace en microscopios extremadamente críticos en tres dimensiones (deconvolucion o microscopio confocal) el grosor del cubreobjetos debería ser medido con un micrómetro y estandarizado excatamente a 0.17 mm.

El cubreobjetos está pegado alobjeto con un cemento soluble en agua, alcohol, o xileno, teniendo un índice de refracción próximo al de este cristal (1.515). Hay un gran número de adhesivos de montaje comerciales incluyendo Permount, Bálsamo de Canadá, Merkoglas, y otros. Los cubreobjetos de plástico pueden ser comprados y usados, sin embargo debido a la refringencia del plástico, la técnica óptica de DIC no trabajará.

 

Procedimiento

Mantener los portaobjetos en xileno mientras le toca el turno de ser procesado. Debes guardar los portaobjetos en contenedores con muecas para un manejo fácil. No permitir que los discos se sequen antes de añadir el medio de montaje o los cortes se dañarán inrreversiblemente.

1.-Quitar el portaobjetos y con un Kimwipe limpiar suavemente alrededor de los bordes para quitar el exceso de xileno.

2.- Añadir 1-3 gotas de medio de montaje. El cemento debe estar bastante líquido pero no acuoso. si el medio de montaje está demasiado espeso, diluir en el solvente apropiado (xileno, alcohol, agua).

3.- Cuidadosamente poner el borde del cubreobjetos (margen corto) sobre el portaobjetos y con un puntero o un forceps bajar lentamente hasta que toque la parte superior del adhesivo. Parar un momento para permitir que se quiten las burbujas de aire.

4.- Continuar bajando el cubreobjetos hasta que todas las gotas de adhesivo toquen el cubreobjetos, entonces detenerse otra vez para permitir que las gotas se mezclen en una. El objetivo es permitir al adhesivo que fluya sobre los cortes sin formar burbujas. las burbujas son extremadamente difíciles de eliminar.

5.- Una vez el adhesivo a formado una capa contínua, dejar que el cubreobjetos se acomode en su lugar en la parte superiror del portaobjetos.

6.- Poner el portaobjetos en una placa calefactora a 42ºC o en un horno y dejar que se seque como mucho overnight. usar una toalla de papel para quitar el exceso de pegamento sobre el portaobjetos en la bandeja calefactora.

 

Medios de montaje para cubreobjetos

La siguiente tabla es una lista corta de medios de montaje habituales, sus sinónimos, y (si es posible) sus usos apropiados. Tener enecuenta que, hasta cierto punto, la elección del medio de montaje es una preferencia personal basada en historia y corte.

Medio de montaje
Compañía*
Solubilidad**
Comentario
Bálsamo de Canadá Fisher, Sigma
X, T
Históricamente importante pero raramente usadodebido a su coste y mejor reemplazo. Endurece y amarillea con los años.
Permout Fisher, EMS, y otros
X, T
Buen medio para propósitos generales. Puede volverse amarillo después de décadas de almacenamiento.
DPX NA
X, T
Usado para aplicaciones en fluorescencia. Consiste en dibutilfeniltalato (10 ml) + poliestireno (25 g) + xileno (70 ml).
DEPEX EMS
X, T
Reemplazo para el Bálsamo de Canadá.
Merkoglass (EM Glass) Merck, EMS
X, T
Buen medio para propósitos generales. Preferido para portaobjetos teñidos in situ co NBT. Endurece en una hora a temperatura ambiente. Muestra alguna retracción.
Eukitt EMS
X, T
Buen medio de montaje para propósitos generales.
BioMount EMS
X, T
Bueno para portaobjetos teñidos con inmunogold/silver.

Cytoseal 60

Cytoseal 280

VWR, T
X, T
Buen medio de montaje para propósitos generales. Se presenta en dos viscosidades, "60" baja y "280" alta.

S/P Accu-Mount 60

Accu-Mount 280

S/P
X, T
Buen medio de montaje para propósitos generales. Se presenta en dos viscosidades, "60" baja y "280" alta. Puede sustituir al cubreobjetos.
PolyGlass P
X, T
Cubreobjetos líquido. Puede reemplazar al cubreobjetos.
Poly-Mount P
X, T
Buen medio de montaje para propósitos generales.
Pro-Tex S/P
X, T
Medio de montaje para propósitos generales.
Meltmount (Gargille) EMS
X, T
Medio de montaje para propósitos generales. Puede ser eliminado mediante calentamiento del portaobjetos. disponible en varios indices de refracción desde 1.593 hasta 1.704.
Coverbond (Piccolyte") S/P
X, T
Medio de montaje para fines generales. "Piccolyte" es el nombre genérico usado para una variedad de polímeros de b-pinene.
Euparal CBS
Agua
Bueno cuando el tejido, la tinción o la matriz no toleran el xileno, por ejemplo material fresco o cortes en plástico. Usado para inmunolocalización. Es propietaria de la fórmula original de Gilson.
Plastic UV Mount P
Alcohol, agua
Bueno cuando el tejido, la tinción o la matriz no toleran el xileno, por ejemplo material fresco o cortes en plástico. Usado para inmunolocalización. Poner una gota o dos de medio sobre los cortes, añadir el cubreobjetos, y endurecer bajo luz UV. Una lámpara portátil de UV de longitud de onda larga (UVL21) funciona bien.
Medio de montaje UV EMS
Agua
Bueno cuando el tejido, la tinción o la matriz no toleran el xileno, por ejemplo material fresco o cortes en plástico. Usado para inmunolocalización. Endurece bajo luz UV. Tiene el mismo índice de refracción que el metacrilato JB-4
Fluoromount-G EMS
Agua
Usado en inmunolocalización fluorescente o en criosección en fresco.
Cristal/Mount (Biomeda) EMS; Fisher
Agua
Usado en inmunolocalización fluorescente o en criosección en fresco. Diseñado para inmunolocalización HRP y AP. No es para ser usado con cubreobjetos, aunque se le puede añadir un cubreobjetos usando Permount espués de haber solidificado el Cristal/Mount.
Gel/Mount (Biomeda) EMS; Fisher
Agua
Utilizado para inmunolocalización fluorescente o criosección en fresco, especialmente bueno para detección de ficobiliproteínas ya que no contiene glicerina. Usar con un cubreobjetos y rodear con laca de uñas.
Aqua-poly/Mount P
Agua
Usado para inmunolocalización fluorescente o criosección en fresco.
Gelatina de glicerina NA
Agua

Agua destilada---------100 ml

Glicerina----------------100 g

Gelatina------------------17 g

Fenol----------------------1 g

Mantener a 4ºC y ablandar sólo pequeñas porciones. Calentar a 37ºC, aplicar a material fresco sobre portaobjetos. Bueno para hacer preparaciones semipermanentes de material fresco. El cubreobjetos puede ser eliminado sumergiendo el portaobjetos en agua caliente.

Medio de Goma Arábiga NA
Agua

Agua destilada----40%

Glicerol-----------20%

Goma Arábiga----40%

Azida-----------0.02%

Mantener a 4ºC. Usado para montar secciones acuosas. Los tejidos deben ser transferidos directamente a Goma Arábiga.

Excepto por la azida, esta es la fórmula original de Farrants

Glicerol/TBS NA
Agua

Glicerol----90%

TBS-------10%

Azida----0.02%

Mantener a 4ºC. Usada para montar cortes tratados para inmunocitoquímica.

Parafina/Permount NA
NA
Mezclar 1:1. Usada para sellar bordes de cubreobjetos para "spodograms" y otros especímenes relativamente secos.
Vaspar NA
NA
Mezclar vaselina y parafina fundida 1:1. Usada para sellar los bordes de cubreobjetos para preparaciones en fresco.
Fingernail polish NA
NA
Usado para sellar los márgenes de cubreobjetos para preparaciones en fresco. Usado especialmente para preparaciones en inmunolocalización.