Tinciones y reconocimientos histoquímicos

El proceso de tinción de corte o tejidos completos es más un arte que una ciencia. La tinción es un resultado de la sinergia entre la adición de tinción, frecuente mente una sal metálica añadida (mordiente), la cantidad de tiempo de tinción, la tinción "diferencial" por componentes adicionales, la cantidad de decolorante (si es necesario), la temperatura durante la tinción (para colorantes "reactivos"), y por supuesto el propio tejido. Algunos colorantes trabajan mejor cuando dan una sobretinción y a continuación son lavados para revelar la estructura celular (tinción regresiva). Otros colorantes tiñen los tejidos tan lentamente que se puede observar la progresión en la tinción y pararlo en el momento más apropiado (tinción progresiva). Los colorantes regresivos son perdonados en esta sobretinción, y la pérdida de detalles celulares, es casi imposible. Las tinciones progresivas, por otra parte, son bastante imperdonables. Una vez se han sobreteñido, los detalles del tejido generalmente se pierden de forma permanente.

 

Clasificación química de los colorantes.

Los colorantes y las microtécnicas en tinción pueden ser agrupadas en clases de acuerdo a su especificidad y estructura química. Las clases que se enumeran aquí pertenecen específicamente a microtécnicas e histoquímica.

Ciertos colorantes muestran un cambio en los picos de absorción (color) después de de unirse a polianiones (bien en solución, o en la célula). Este cambio de color en fluorescencia se denomina metacromasia y el colorante se llama colorante metacromático.Erhlich usó el término "matriz ortocromática" para referirse al color de la solución de colorante y "matriz metacromática" al color del complejo colorante-tejido. No confundir con colorante "policromático", el cual es un colorante compuesto o una mezcla de colorantes que consisten en más de un colorante, y por tanto más de un color.

Ejemplos son el TBO, violeta de metilo, y algunos colorantes de Acridina. Por ejemplo tejidos teñidos con Azul de Toluidina O puenden variar de azul oscuro/ púrpura hata azul muy claro a rosa, dependiendo de los cmponentes celulares a los que se une el TBO. Otros colorantes metacromáticos son Tionina, Azul A, B, C, Violeta de Cresilo, Violeta de Metilo y Azul Celestina.

Hay cientos de métodos de tinción, sin embargo, todos los métodos siguen ciertos procedimientos generalizados dependiendo si los cortes a teñir fueron encastrados en parafina o plástico. Los tejidos encastrados en parafina deben ser desparafinadso usando Histo-Clear o xileno, mientras que los cortes encastrados en plástico mantienen la matriz durante los pasos de tinción. De los muchos pasos de tinción diseñados por los investigadores, sólo unos pocos son usados generalmente en microtécnicas vegetales. Entre las innumerables tinciones químicas disponibles para investigación hitológica, las microtécnicas vegetales han tendido a limitar su uso a sólo unas pocas- Safranina, Verde Rapido, y Hematoxilina siendo las más destacables.

 

Colorantes químicos

Las moléculas de colorante deben reaccionar con componentes celulares bien por uniones no covalentes (inónicos, puentes de hidrógeno, hidrofóbicas) o covalentes. El pH de la solución del colorante puede determinar la extensión de la tinción mientras que la reactividad de una molécula colorante con el tejido es dependiente a mendudo del cambio.

Las tinciones no covalentes, particularmente asociaciones iónicas, cueden ser inestables y el colorante puede perderse del tejido, resultado en una tinción débil. Además, las diferencias en el pH y la concentración en sales dentro del tejido pueden dar como resultado en tinciones diferenciales. Por tanto, la interacción iónica de la molécula colorante al componente del tejido puede ser inherentemente inespecífica, y depende del estado iónico de la molécula diana (componente celular) y el ambiente en el cual la diana resida.

Los colorantes catiónicos ("colorantes básicos") son atraídos a los componentes celulares que son ácidos de forma natural (cargados negativamente, basofílicos). Ejemplos son la Safranina O, Cristal Violeta, acetocarmín, y Azul de Toluidina O. Colorantes aniónicos ("colorantes ácidos") son atraídos por componentes celulares que son básicos (cargados positivamente; acidófilos). Un ejemplo es el Verde Rápido FCF, que preferentemente tiñe componentes tales como la celulosa y el citoplasma. Otros colorantes ácidos son el Naranja G y el Azul de Anilina.

Como contraste, los enlaces covalentes de las moléculas de colorante resultan en un complejo excesivamente estable que puede ser bastante específico. Ivanov se refiere a colorantes que reaccionan covalentemente como colorantes reactivos ya que contienen un grupo que reacciona con grupos funcionales en los componentes celulares. Los colorantes reactivos son usados extensivamente en la industria textil pero no frecuentemente en biología. Los colorantes reactivos más prometedores son los colorantes diclorotriazina en el grupo Promoción M de colorantes comerciales.

 

Mordientes

El término mordiente se refiere a cualquier compuesto, añadido antes o después de la tinción, que realza las propiedades de tinción de un colorante. Los mordientes son generalmente metales como el manganeso, crómico, alumínico. Sin embargo, un mordiente también debe ser un compuesto tal como el ácdio acético o el pícrico que es añadido para lavar la solución para realzar el brillo de una tinción como la eosina o el eritrosin (ácido acético) o colorantes violeta (ácido pícrico). Los átomos metálicos (ligandos) pueden formar un complejo multiátomo con moléculas de agua in situ. Durante la tinción, algunas de estas moléculas de agua pueden ser intercambiadas por los grupos ligando de la molécula colorante formando un quelato entre el colorante y el metal, al que se refieren algunas veces como "lago".

Tradicionalmente, los metales quelantes se han denominado mordientes, y han sidu usados para facilitar la tinción principalmente de ácidos nucleicos. Los do complejos colorante/mordiente más comunos son las tinciones nucleares Hematoxilina y Gallocianina, y el metal quelante usado puede ser Al3+, Fe3+/2+ o Cr3+. El agente quelante puede determinar la selectividad del colorante. La Hematoxilina-cromica es específicapara ácidos nucleicos, pero tiñe más bien poco. La Hematoxilina Férrica tiñe rápidamente, pero puede producir una tinción de fondo mayor.

 

Interacciones covalentes- colorantes reactivos

Una molécula de colorante reactivo está formada generalmente por dos componentes: el revelador de color (cromóforo) y el componente reactivo (auxocromo) generalmente reaccionando con un grupo hidroxil, amino o tiol del sustrato. Si el componente del cromóforo de la molécula es fluorescente se conoce entonces como fluoróforo.

 

Tinciones para técnicas microscópicas

A continuación presentamos tinciones para técnicas microscópicas con plantas. Se trata de una serie de protocolos que se irán ampliado en la medida en que se vayan adquiriendo nuevos conocimientos y se pongan en marcha nuevos protocolos de tinción.

 

 

Eliminación de colorantes de las manos

Aquí se presentan algunas directrices para eliminar colorantes de la manos y de la ropa. Tener en mente sin embargo, que la mayoría de colorantes biológicos son permanentes. La coloración desaparecerá eventualmente de tus manos, pero no de tu ropa.

Fucsina básica Acido acético fuerte en EtOH 95%, o diluir HCl
Carmín Agua amónica fuerte o HCl débil
Acido crómico Diluir H2SO4 en agua, o tiosulfato sódico concentrado con unas pocas gotas de H2SO4 añadidas
Verde Rápido Agua amoniacada (puede funcionar con otras tinciones ácidas)
Violeta de Gentiana EtOH ácido
Hematoxilina Acido débil o zumo de limón
Iodina Solución de tiosulfato sódico
Alumbre férrico Para tinciones u objetos de cristal usar NaOH fuerte en agua seguido por HCl fuerte
Azul de Metileno Alcohol ácido o tintura de jabón verde
Acido pícrico Carbonato de litio o ioduro de litio (acuoso)
Safranina O EtOH ácido
Borrador general Cualquier jabón arenoso como "Boraxo"; las tinciones son difíciles de eliminar, sin embargo en alglunos círculos tradicionales, las manos teñidas se piensa que son un signo de proezas de microtécnicas.